腫瘤免疫治療，實際上分為兩大類：
一種把腫瘤的特征“告訴”免疫細(xì)胞，讓它們?nèi)ザㄎ唬⒃斐蓺?，例如CAR-T、TCR-T、TIL、MASCT（DC-CTL）等；
另一種是解除腫瘤對免疫的耐受/屏蔽作用，讓免疫細(xì)胞重新認(rèn)識腫瘤細(xì)胞，對腫瘤產(chǎn)生攻擊，例如PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體等。臨床上將不同的免疫療法聯(lián)合應(yīng)用效果有可能會更好。
目前有三種使用效應(yīng)T細(xì)胞的過繼細(xì)胞療法(Adoptive cellular therap,ACT)正朝著注冊審批的方向行進(jìn)（圖1）。
圖1：目前細(xì)胞治療的幾種途徑
腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TILs）雖發(fā)展緩慢，但數(shù)十年來一直進(jìn)步，近期一項針對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的國際III期隨機(jī)試驗已經(jīng)完成（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00200577），這項研究前后經(jīng)歷十多年，最終結(jié)果還是不錯的，不管在復(fù)發(fā)還是長期生存方面，TILs都是有效的。
那么，什么是CAR-T和TCR-T呢？
CAR-T（Chimeric Antibody Receptor Engineered T Cell）和基因修改的T細(xì)胞受體（Gene Modified TCR）。這兩種技術(shù)的一個共同點在于通過基因改造的手段提高T細(xì)胞受體對特異性癌癥細(xì)胞抗原的識別能力和進(jìn)攻能力。因此也都統(tǒng)稱為“T細(xì)胞受體重新定向”技術(shù)（Tcell receptor redirection）。但兩者所使用的方法是不同的。
嵌合抗原受體T細(xì)胞技術(shù)（CAR-T）以及T細(xì)胞受體（TCR）嵌合型T細(xì)胞（TCR-T）作為當(dāng)前過繼性細(xì)胞回輸治療ACT技術(shù)兩大最新的免疫細(xì)胞技術(shù)，因其能夠表達(dá)特異性受體靶向識別特異性的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞，受到廣泛的關(guān)注和研究，從最開始的基礎(chǔ)免疫研究轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床應(yīng)用?；诤铣缮飳W(xué)，免疫學(xué)，遺傳改造技術(shù)，使得合成改造的特異性功能加強(qiáng)版的T細(xì)胞成為可能。CD19抗原特異性CAR-T 細(xì)胞用于治療B細(xì)胞白血病和淋巴瘤臨床試驗中，顯示出持續(xù)的疾病緩解效果。由于CAR-T/TCR-T技術(shù)的優(yōu)越表現(xiàn)，以及廣闊的應(yīng)用前景，從而使其進(jìn)入了當(dāng)前激烈的制藥行業(yè)競技舞臺中與傳統(tǒng)的制藥業(yè)一較高低。
通過修飾，使正常供體細(xì)胞的同種異體排異反應(yīng)失活，同時使用抗腫瘤的CAR或TCR武裝它；或利用抗腫瘤分子武裝患者自體細(xì)胞。在實體腫瘤中，活檢標(biāo)本可用來分離TILs并進(jìn)行擴(kuò)增。大多數(shù)情況下，病人在接受抗腫瘤淋巴細(xì)胞輸注前需要接受必要的預(yù)處理，并須謹(jǐn)慎處置治療引發(fā)的毒性。
T細(xì)胞和T細(xì)胞受體
T細(xì)胞是我們肌體細(xì)胞免疫機(jī)制中非常重要的一類細(xì)胞。這類細(xì)胞之所以被稱為T細(xì)胞是因為它們成熟和分化的過程是在胸腺（Thymus）里完成的。
T細(xì)胞有一點像我們身體的“紀(jì)委巡視組”。它們在肌體內(nèi)巡邏時，不斷地和各種細(xì)胞進(jìn)行“親密”接觸，以檢查細(xì)胞內(nèi)部是否正常。而這種接觸和檢查工作主要是通過一種稱之為“T細(xì)胞受體”來進(jìn)行的。細(xì)胞方面和“T細(xì)胞受體”交接的是一類被稱為“MHC”（或者在人類被稱為HLA）的表面蛋白。這類蛋白的功能就是把細(xì)胞內(nèi)部蛋白分解后的片段呈現(xiàn)給T細(xì)胞。供T細(xì)胞檢查。如果T-細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其中有變異的蛋白片段，就可能對細(xì)胞發(fā)起進(jìn)攻，摧毀變異的細(xì)胞。這也就是我們免疫系統(tǒng)如何能夠長期保持我們無癌生活的主要原因。
但癌癥還是會經(jīng)常發(fā)生。這里的原因固然很多，也很復(fù)雜。但總體來講，癌癥發(fā)生說明我們的T細(xì)胞已經(jīng)失去了識別癌細(xì)胞以及摧毀癌細(xì)胞的能力。而提高T細(xì)胞識別能力的關(guān)鍵就在于改進(jìn)“T細(xì)胞受體”。從這個角度去思考，就產(chǎn)生了我們剛剛提到的這兩種細(xì)胞免疫治療技術(shù)：CAR-T和基因修改的T細(xì)胞受體。
CAR-T與TCR-T的區(qū)別
我們可以打一個簡單的比喻。CAR-T是一種“換頭”技術(shù)。它把TCR的“頭”直接換成一個特異性的抗體。這樣就可以讓T細(xì)胞就在抗體的指引下直接攻擊癌細(xì)胞。和CAR-T這種大手筆的改動相比，基因修改的T細(xì)胞受體可以說只是簡單地“理了理發(fā)”。
用來“理發(fā)”的T-細(xì)胞并非任何T細(xì)胞。這類T細(xì)胞通常會“侵入”癌組織。這說明他們對癌細(xì)胞有一定的識別能力。事實上，我們可以在這類T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)對癌細(xì)胞相關(guān)抗原（Tumor Associated Antigen, TAA）具有特異性識別能力的T細(xì)胞。這類抗原包括CEA，Her-2，CD19，gp100, MART-1, MAGA-A3, NY-ESO-1, 等等。這些TAA在不同的癌癥中都有相對特殊性的表達(dá)。因而也成為免疫系統(tǒng)的攻擊對象。盡管如此，這些天然（或者通過其他手段制造的）的“抗癌”T細(xì)胞的識別能力常常比較弱，因此不能形成對癌細(xì)胞的有利攻擊。在這種情況下，可以通過部分基因修改的方法來提高這些TCR對相應(yīng)TAA的“親和力”和戰(zhàn)斗力?！盎蛐薷牡腡CR”技術(shù)也因此被稱為“親和力增強(qiáng)的TCR”技術(shù)（Affinity-Enhanced TCR）。
這次《自然-醫(yī)學(xué)》雜志報道的就是由美國馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濱州大學(xué)醫(yī)學(xué)院和目前免疫治療的“當(dāng)紅炸子雞”之一：Adaptimmune公司聯(lián)合研發(fā)的一款“基因修改的TCR”。在修改了幾個關(guān)鍵氨基酸以后，這些基因修改的TCR大大提高了和一種常見的癌癥TAA，NY-ESO-1，的親和力。從而可以用來進(jìn)攻有NY-ESO-1過量表達(dá)的癌癥，比如多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma）。 在這次臨床試驗中，80%的多發(fā)性骨髓瘤患者有了很好的臨床應(yīng)答。其中70%的患者達(dá)到完全或接近完全應(yīng)答。平均無進(jìn)展生存期達(dá)到了19個月。這樣的結(jié)果可以說是非常驚人振奮的。
目前這兩種方法，發(fā)展都比較迅速，但是都不完美。
開發(fā)最佳的CAR設(shè)計
過去的20年中CAR的設(shè)計已經(jīng)取得了長足的進(jìn)展（圖2）。1991年有3個實驗室報道了第一代CAR的設(shè)計。Kuwana等人最先構(gòu)造了嵌合受體，使T細(xì)胞不依賴于MHC-I類分子識別靶細(xì)胞。Roberts、Finney和 Lawson 率先構(gòu)造了含有CD28或4-1BB共刺激分子的二代CAR。在臨床前模型中，使用基于CD28的體外擴(kuò)增體系，在異種移植瘤模型中 4-1BB比CD28對CAR的功效更有益。兩種CAR模型都顯示出臨床前和臨床療效。Long等人的最近研究表明，基于CD28構(gòu)造的CAR加強(qiáng)并加速T細(xì)胞衰竭，而基于4-1BB構(gòu)造的CAR減緩了T細(xì)胞衰竭。我們的研究結(jié)果與其結(jié)論一致，并且發(fā)現(xiàn)CD28內(nèi)切域能傳遞使效應(yīng)T細(xì)胞終末分化的信號。從這些研究中得出的周密的結(jié)論并不是說某個人源內(nèi)切域必然比另一個好，而是說CD28信號是生產(chǎn)有效的臨床T細(xì)胞制品的關(guān)鍵，而4-1BB提升了CAR-T細(xì)胞的持久性。
圖2：CAR-T細(xì)胞的設(shè)計
第一代CAR引入了CD3ζ鏈或類似的信號域?；诳贵w再定向的T細(xì)胞首先由Kuwana設(shè)計并由Eshhar完善。Roberts和Finney首先設(shè)計了整合CD28或CD137信號域的第二代CARs
為了進(jìn)一步改良CAR的設(shè)計，許多研究組開始著眼于發(fā)展第三代CAR，不僅包括“信號1”、“信號2”，還包括了額外的共刺激信號。不同研究者們用不同材料開展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比較結(jié)果是矛盾的。不過，新一代CAR-T能有效控制毒性。
透視ACT毒性
十多年來，許多ACT臨床試驗表明各類工程化的細(xì)胞產(chǎn)品相當(dāng)安全，但有效性相對缺乏。過去的4年里，ACT的療效發(fā)生了一場革命性變化，體現(xiàn)在工程化的T細(xì)胞可以在體內(nèi)大量擴(kuò)增，甚至在某些情況下可以持續(xù)性存活。這徹底的改變了ACT的療效，尤其體現(xiàn)在CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于癌癥治療，但是在顯示出療效的同時，伴隨有毒性。
細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）
CAR-T治療骨髓源腫瘤最顯著的毒性是CRS。高度增殖的T細(xì)胞能引起CRS，表現(xiàn)為高熱和肌痛，不穩(wěn)定的低血壓和呼吸衰竭。這是一個意想不到的結(jié)果，因為在臨床前動物模型中沒有出現(xiàn)類似癥狀。
從CRS觀察中發(fā)現(xiàn)一個關(guān)鍵的點，除了預(yù)期的效應(yīng)細(xì)胞因子INF-γ外，IL-6在CAR-T治療的細(xì)胞指數(shù)級增殖期間也會迅速提升。CRS可能直接與另一個毒性相關(guān)聯(lián)，即巨噬細(xì)胞活化綜合征。
幸運(yùn)的是，針對這些嚴(yán)重的CRS，尋找到了一種治療方法，應(yīng)用IL-6受體拮抗劑tocilizumab來阻斷IL-6的作用。采用高度增殖的CAR-T治療ALL患者，確認(rèn)了IL-6的出現(xiàn)和tocilizumab對嚴(yán)重CRS的療效，并且我們觀察到了雙特異性T細(xì)胞銜接抗體blinatumomab引起的嚴(yán)重CRS具有類似機(jī)制。
另一個重要發(fā)現(xiàn)是，嚴(yán)重的CRS幾乎發(fā)生在高疾病負(fù)荷病人身上。這意味著將CAR應(yīng)用于疾病早期患者身上，在疾病惡化之前使用CAR-T來殺滅腫瘤，發(fā)生嚴(yán)重CRS風(fēng)險將大大降低。
關(guān)于靶向毒性
T細(xì)胞增殖可直接導(dǎo)致CRS。它不依賴于改造的T細(xì)胞的抗原特異性，即使CAR是相同的，治療不同的疾病有可能CRS風(fēng)險和癥狀也會有所不同。例如在治療CLL和彌漫大B時CRS較輕而治療ALL時CRS相對較重。
除了CRS，還存在由工程改造的T細(xì)胞的抗原特異性導(dǎo)致的“靶向”毒性。例如溶瘤綜合征，它直接是由腫瘤細(xì)胞的裂解而導(dǎo)致的。當(dāng)CARs靶向于B細(xì)胞表面表達(dá)的靶點如CD19時，會引起B(yǎng)細(xì)胞發(fā)育不良，這就是一個“靶向”毒性，但卻錯誤的攻擊了正常組織細(xì)胞的結(jié)果。只要CD19 CAR-T細(xì)胞長時間存在，B細(xì)胞發(fā)育不良的情況就不會改善，因此，B細(xì)胞缺乏可作為CAR-T療效持續(xù)的標(biāo)志。B細(xì)胞發(fā)育不良與CD20特異性單抗治療一樣會造成嚴(yán)重的低丙種球蛋白血癥，需要靜脈注射免疫球蛋白。不像CD20 單抗 rituximab引起的相對較輕的低丙種球蛋白血癥，CAR引起的長期B細(xì)胞發(fā)育不良，靜脈注射免疫球蛋白非常必要。
最近報告了輸注改造的T細(xì)胞引發(fā)致命毒性的2個案例，有一例患者接受了HER2-CAR治療，兩例患者接受了靶向MAGE-A3的TCR-T細(xì)胞治療。在這2個案例中，均是因為正常組織表達(dá)這些靶點，導(dǎo)致急性不可逆的心肺毒性。所有的靶向毒性均是由于改造的T細(xì)胞無法區(qū)別表達(dá)靶向抗原的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞所致。高親和力TCR改造的T細(xì)胞引起的毒性可能與親和力成熟過程有關(guān)，因為“非腫瘤靶向”的高親和力TCR的產(chǎn)生在生理條件下將受到限制。在設(shè)計TCR的過程中，小心篩選高親和力的TCRs，并研究其對靶蛋白之外的其他抗原表位的識別顯得十分必要。根據(jù)已有報道，輸注HLA-A2/MAGE-A3特異性的TCR-T細(xì)胞能夠產(chǎn)生神經(jīng)毒性。
神經(jīng)毒性
CAR-T治療白血病會引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，這是一個預(yù)期之外且目前尚不清楚的現(xiàn)象。幾個研究小組報道，這些癥狀具有多樣性但可自行消退，如譫妄、語言障礙、運(yùn)動障礙、緘默癥和癲癇發(fā)作。雖然與全身CRS的發(fā)生有些時間上的關(guān)聯(lián)，當(dāng)然也與CAR-T存在于腦脊液中相關(guān)，但是使用tocilizumab這些癥狀不會有改變。這些癥狀的機(jī)制與靶組織仍有待確認(rèn)。
其他毒性
輸注活化的T細(xì)胞存在引起自身免疫性疾病的風(fēng)險。靶向黑色素瘤的ACT治療可誘發(fā)白癜風(fēng)。輸注活化的T細(xì)胞產(chǎn)生如皮疹、結(jié)腸炎、垂體炎等毒性的報道較少。CAR修飾的T細(xì)胞尚未出現(xiàn)這些問題。輸注同種異體T細(xì)胞存在抗宿主移植病的潛在風(fēng)險。這可能會引起曾接受同種異體造血干細(xì)胞移植的患者的擔(dān)心。幸運(yùn)的是，從受體采集已耐受供體來源的T細(xì)胞（而不是捐獻(xiàn)者），抗移植物宿主病的風(fēng)險會非常低。當(dāng)然有一種方法是利用自殺系統(tǒng)來限制毒性，如經(jīng)典的caspase-9 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，或包含特定表面靶點如CD20。在含有caspase-9誘導(dǎo)系統(tǒng)下，一種水溶性活化劑可激活Caspase系統(tǒng)導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡。包含CD20基因修飾的CAR-T細(xì)胞，可用單抗如rituximab來清除“違規(guī)”的細(xì)胞。
該領(lǐng)域面臨的問題
近期實驗室研究正在解決在科學(xué)與工程方面遇到許多挑戰(zhàn)。下面我們談一談當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)。
細(xì)胞制品的構(gòu)成:
早期的細(xì)胞治療主要是輸注高分化的CD8+T細(xì)胞。這些CTL細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但是輸注后沒有足夠的復(fù)制能力，除了個別情況外，注入患者體內(nèi)的T細(xì)胞持久性較差。目前普遍同時輸注CD4+與CD8+T細(xì)胞，很可能是因為CD4+T細(xì)胞提供生長因子和其他信號以維持輸注的CTL的功能和活性。
另外，在小鼠中的研究有時候會誤導(dǎo)處理人源T細(xì)胞的方法。例如，由于受到端粒退化的影響，人源T細(xì)胞的復(fù)制能力有限，在小鼠模型中卻沒有這個特點，而人CD4+細(xì)胞比小鼠CD4+細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。現(xiàn)在的問題是是否需要利用流式細(xì)胞術(shù)或其他的方法分離細(xì)胞亞群并進(jìn)行獨立培養(yǎng)。CD4+和CD8+T細(xì)胞最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件不同，這因為CD4 +和CD8 + T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不一樣。此外，細(xì)胞分離法可去除對效應(yīng)T細(xì)胞療法存在潛在危害的Treg細(xì)胞。況且，需要從輸注的T細(xì)胞中去除腫瘤細(xì)胞，對白血病患者而言，這尤其具有挑戰(zhàn)性。然而，在GMP生產(chǎn)中有些技術(shù)使細(xì)胞制備成本大大增加，如通過流式細(xì)胞術(shù)或磁珠分選細(xì)胞可使成本迅速增加10000美元甚至更多。
年齡問題:
與上述問題相關(guān)，輸注處于什么分化階段的T細(xì)胞最佳？對小鼠和人類的研究結(jié)果表明，naive或中心記憶細(xì)胞是最好的。對只有少量naive T細(xì)胞的老年人而言，如何獲取這類細(xì)胞是個挑戰(zhàn)，且化療或其他疾病通常會進(jìn)一步放大難度。
從采用CD19 特異性CAR-T治療白血病患者的數(shù)據(jù)中表明，擴(kuò)增能力是預(yù)測成功的最重要的生物學(xué)標(biāo)志。一種方法是在全血淋巴細(xì)胞中分離中心記憶或naive T細(xì)胞。與此相反，一個更簡便粗放的方法是使用大量T細(xì)胞在特定培養(yǎng)條件下維持naive或中心型記憶細(xì)胞的擴(kuò)增。
后一種方法基于特異性共刺激信號可以促使細(xì)胞定向分化的原理。如CD28的刺激可使CD4細(xì)胞保持中心記憶細(xì)胞狀態(tài)，4-1BB可以促使CD8中心記憶細(xì)胞的增殖。相反ICOS共刺激分子可以促使和穩(wěn)定Th17細(xì)胞的生長。利用T細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性是非常有希望的，Wnt信號通路的激活可以促進(jìn)記憶干細(xì)胞的增殖。
是否存在統(tǒng)一的最佳細(xì)胞制品配方？抑或針對不同的腫瘤需要不同的配方？
CD19 CAR-T治療B細(xì)胞惡性腫瘤顯示出的驚人且意想不到的療效能否出現(xiàn)在治療實體瘤患者身上還未可知。我們發(fā)現(xiàn)CAR-T在體外殺滅低分化腺癌細(xì)胞的效率類似于白血病。然而，仍然有待進(jìn)一步確定是否需要修改細(xì)胞組成類型或細(xì)胞培養(yǎng)條件，用來優(yōu)化實體瘤患者體內(nèi)改造的T細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和持久性。
與惡性血液疾病的散在分布不同，采用細(xì)胞工程的方法優(yōu)化T細(xì)胞向?qū)嶓w瘤塊轉(zhuǎn)運(yùn)，如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和胰腺癌，可能會有所不同。已提出一種方法是利用靶向策略，如采用基因工程的手段，使用各種趨化因子或趨化因子受體促使T細(xì)胞向腫瘤部位富集。其他方法包括對腫瘤或患者進(jìn)行預(yù)處理，如進(jìn)行放療，注射溶瘤載體以及在瘤內(nèi)直接注射T細(xì)胞。
最優(yōu)的共激活結(jié)構(gòu)域在CD4+和CD8+ T細(xì)胞內(nèi)是一樣的嗎？
以往研究表明不同亞群的T細(xì)胞培養(yǎng)條件是不同的。這就提出一個問題，不同淋巴細(xì)胞亞群的T細(xì)胞是否需要不同的信號分子進(jìn)行武裝呢？為著手解決這個問題對CD4+和CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)區(qū)CD28, 4-1BB和ICOS進(jìn)行了評估。在異種移植腺癌的人源化小鼠中，我們發(fā)現(xiàn)采用ICOS信號域的CD4+ CAR-T細(xì)胞更為優(yōu)越，而CD8+T細(xì)胞常優(yōu)選4-1BB。如此增加細(xì)胞制備的復(fù)雜度是否能使臨床實驗受益尚有待進(jìn)一步確定。此外，最佳的T細(xì)胞亞群比例和信號分子的構(gòu)造在不同的腫瘤微環(huán)境中很可能會有差異。比如在一些臨床前腫瘤模型中改造的Th17細(xì)胞比Th1細(xì)胞更優(yōu)越。
生存與毀滅：自殺結(jié)構(gòu)能否減弱非腫瘤靶向引起的毒性?
使用改造的T細(xì)胞最大的不確定性是利用生物合成技術(shù)誘導(dǎo)的新的、增強(qiáng)的細(xì)胞效應(yīng)是否會引發(fā)意外的脫靶毒性。
CAR-T細(xì)胞的非腫瘤靶向毒性和TCR細(xì)胞的脫靶毒性被格外關(guān)注。有多種方法可以緩解這些問題。我們發(fā)現(xiàn)利用編碼CAR的mRNA轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，限制CAR僅在轉(zhuǎn)染T細(xì)胞中表達(dá)，對評估出現(xiàn)的直接毒性有幫助。當(dāng)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，停止細(xì)胞輸注，毒性會迅速減弱。研究人員也提出了許多誘導(dǎo)基因修飾T細(xì)胞凋亡的方法。這些方法很可能都會被整合，以便按需清除T細(xì)胞，滿足嚴(yán)格的安全需求。
結(jié) 論
基于正在進(jìn)行的試驗，表達(dá)CARS和TCRS的T細(xì)胞已經(jīng)為廣泛的商業(yè)應(yīng)用準(zhǔn)備就緒。華爾街的資源正推動這個曾因投資不足而被限制的領(lǐng)域的進(jìn)步。在輸注的T細(xì)胞中引入或刪除基因，提供了能克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境的新細(xì)胞制品，并且最后可能不需要使用免疫檢查點封閉抗體。ACT先進(jìn)的基因工程技術(shù)的到來，將會使利用合成生物學(xué)原理進(jìn)行癌癥、慢性感染和自身免疫性疾病的治療取得顯著進(jìn)展。
